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化学发光试剂使用方法及原理

日期:2015-09-02浏览:1608次

 一、化学发光试剂用途:
  本试剂是非放射性发光系统,用于检测固定在膜上的蛋白,其敏感性达1-5pg。用X光片可快速地获得*的硬拷贝结果。所含独特的底物足以维持12小时以上的发光,便于反复曝光操作,免疫印迹膜经抗体脱卸处理后可供再次抗体探查使用。适用于痕量蛋白或核酸检测。特别节省抗体(一抗1:500-1:5000,二抗1:3000-1:10000)。
二、化学发光试剂原理:
  辣根过氧化酶使试剂中的发光物(Luminol)氧化并发光,而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。在免疫印迹中,将复杂的蛋白混合物经SDS-PAGE分离,并转移到固相膜上(如NC、PVDF)等,用于免疫学检测,经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接(标记一抗)或间接(标记二抗)反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后,Luminol发生氧化降解,并发射波长为428nm的光,此光可经X光胶片(放射自显影片)感光记录下来。
三、使用方法:
1. 印迹膜制备 按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作,适当的封闭非常重要。可以通过标记一抗或二抗的手段引入HRP,一般采用市售的HRP二抗交联物。仔细地淋洗对于降低背景非常重要,在与HRP交联物温育后,膜片更需仔细洗涤,所有步骤均在室温下完成。
2. 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合A液和B液,混合后尽快使用。将膜片置混合液中于室温下振荡温育2分钟,每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆盖全膜片。
3.蛋白信号显现
1). 用平头镊钳住膜片,垂直置于吸水纸以吸去过量试剂。
2). 置膜片于二层保鲜膜之间,小心赶尽气泡。
3). 将膜片吸附蛋白面朝上,置于X光片盒中。
4). 于暗室中压上X光片。
5).根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min或5min,也可选择不同时间多次压片,以达*效果。显影冲洗。
6). 调节曝光时间,再次曝光显影。
4、膜的重复使用:
配置62.5mM Tris-Hcl,PH6.7,2%SDS, 7ml/100ml的巯基乙醇的溶液,膜放入后,70?C振荡水浴30分钟。再用TBST或PBST缓冲液洗脱,zui后用BSA(牛血清白蛋白)或牛奶封闭。
四、化学发光试剂操作注意:
1. 本试剂每个批号均独立优化,请不要混用或稀释本试剂以免降低敏感性;
2. 加入一抗后膜不能再干燥;
3. 适当地封闭和洗涤膜片至关重要;
4. 使用前配置化学发光试剂,配置足够覆盖膜片即可,弃去使用过的混合试剂;
5. 使用干净取样头取用每种试剂;
6. *张片子建议曝光1分钟,观察结果后判断*曝光时间可从30秒至2小时不等;
7. 除了放射自显影片曝光和洗片处理外,所有步骤均不必在暗室中操作;
8. 膜片可经适当方法洗脱原有抗体,再次印迹使用,在此情况下,此试剂更为理想;
9. 因为它不象生色物质需要从膜片上清除底物。
10. NaN3能抑制HRP活性,应避免使用NaN3。

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